PCR可以扩增单个DNA分子。事实上，许多测序仪——更老的Illumina模型，如MiSeq或NextSeq 2000，已经停产的454,Ion Torrent, Ultima, Genapsys——都依赖于单分子PCR，但规模非常大——许多这样的PCR是并行的。
但更少的模板意味着更有可能脱靶扩增，因为闲置引物是魔鬼的分子生物学车间。由于扩增产物的绝对数量增长非常缓慢，引物可以与任何其他物质结合。
生物或环境样品也可能含有PCR抑制剂-血红素是一种臭名昭著的抑制剂。较少的模板比较多的模板更难放大
对于非常复杂的样本，如环境样本，如果你要寻找一个罕见的目标，输入DNA的数量可能决定成功。或者只是考虑从提取的人类DNA中进行扩增——如果你不放入几个基因组等价物，你很可能在PCR反应中没有任何目标基因的模板副本。
