如何用质谱鉴定蛋白质？

通常情况下，你需要一个非常昂贵的MS，因为你需要超高的分辨率。MS蛋白测序有两种类型，自上而下和自下而上。使用自顶向下的方法，你只需将你的蛋白质溶液（或者更典型的是被消化的蛋白质）注入MS，然后让高通和低通过滤器进行肽分离。这需要大量的蛋白质供应，所以这当然是一种对单个纯化蛋白质进行测序的方法。

使用自底向上，可以使用泥浆剖析方法。你消化你的样本并将肽吸附在疏水吸附柱上。洗脱液梯度分离吸附肽以获得更高的分辨率（当然，如果出于某些原因，你可以在另一个维度增加分离）。这是确定细胞蛋白质组（样本中所有蛋白质的整体）的典型方法。

通常情况下，在分析之前，你要先消化你的蛋白质，用一些内切蛋白酶切割特定的氨基酸。是否完全或部分是一种哲学，这取决于你看的是什么。这里的一个很好的方法是FASP方法，蛋白质样品的消化在带有过滤底部的孔板中进行。在离心过程中，只有消化后的蛋白质片段才能通过过滤器。蛋白酶和其他未消化的蛋白质被留在了后面，不会产生相当多的噪音。

然后这些物质被注射到多发性硬化症中，自上而下，或者更可能是自下而上。多肽通过ESI电离，因此ms可以处理它们。根据电压的不同，ms可以向多肽引入轻微的电荷，甚至如果你过度使用，会使它们破碎，这不是你通常想要的。

MS的下一步是筛选通过的电离多肽。我只有一些使用Orbitrap的经验，它可以捕获肽并决定它们的质量，当然，其他探测器也可以用它们特定的优点和缺点来完成这项工作。考虑到这个筛选过程需要一些时间，而且你既不想浪费时间也不想浪费样品材料，MS会捕获仍在进行的离子流，然后通过特定的质量/电子范围进行碎片化。然后是下一个质量/电子范围。然后其他缩氨酸在MS中结束因为我们运行梯度，重复这个过程。这最终导致在MS输入中对碎片的整个频谱进行分析。

因为每一步都需要时间，而且你要让设备管理相当多的工作，蛋白质组学的MS被划分得相当清楚，每个角落都有专门用于特定目的的离子陷阱。

这些小范围的多肽会被分解，这有不同的方法。通常在四极子（或更高的多极子）中，在存在少量惰性碰撞气体的情况下摆动它们。然后它们进入最后的探测器。这样你就可以通过你最初消化的样本中的所有缩氨酸。

软件当然是核心部分。它记录哪些肽出现在筛选中，决定哪个质量范围被发送去片段化，然后再次记录得到的媳妇团是什么。该软件创建了碎片表，其中包含可能的分子产物及其质量，包括同位素表，因为自然界并不只使用标准同位素。这一点需要一个强大的计算机来做所有的计算，将质量与预期的碎片联系起来，以及一个强大的MS，因为你只需要荒谬的准确性来区分不同的多肽，考虑到它们由于同位素而具有一系列的质量。

通常情况下，你做一个自下而上的文库搜索，你有一个基因组，你知道所使用的蛋白酶会带来什么，你知道会有什么样的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化等），然后软件会做令人难以置信的事情，并将所有事情关联起来。噗的一声，你得到了几gb的数据，包含了一列检测到的肽。好在我们不用再用算盘了。

最后一步是将这些（有时是重叠的）片段在硅材料中拼接起来，并从中确定覆盖范围。一些肽片段根本不喜欢被电离，或者因为其他原因根本没有进入你的探测器，所以你的覆盖范围会有漏洞。一些肽块与其他片段的匹配过于紧密，即使是用MS-MS。有些多肽并不是唯一的，在任何细胞中都有大量重复的蛋白质序列。软件计算特定片段属于所述蛋白质的概率。然后，在你的电脑热了好几个小时之后，因为公司开发了极其昂贵的计算机- ms设置仍然通过CPU而不是GPU运行高度并行的算法，你就有了你的频谱。